【以下为译文，英文版原文参考：https://www.opastpublishers.com/open-access-articles/the-most-effective-selfsustaining-antitumor-responses-activated-by-antipd1-antibody-are-likely-mediated-by-pd1negative-t.pdf https://www.opastpublishers.com/open-access-articles/the-most-effective-selfsustaining-antitumor-responses-activated-by-antipd1-antibody-are-likely-mediated-by-pd1negative-t.pdf://www.opastpublishers.com/open-access-articles/the-most-effective-selfsustaining-antitumor-responses-activated-by-antipd1-antibody-are-likely-mediated-by-pd1negative-t.pdf://www.opastpublishers.com/open-access-articles/the-most-effective-selfsustaining-antitumor-responses-activated-by-antipd1-antibody-are-likely-mediated-by-pd1negative-t.pdf/articles/supporting-cases-for-the-depletion-model-of-immune-checkpoint-inhibitor-therapy-in-cancer.pdf】

摘要

免疫检查点抑制剂(ICI)疗法通过展示一些有史以来最具戏剧性和持久性的抗肿瘤反应，改变了癌症治疗的战场。然而ICI治疗仅在少数癌症患者中有效。在应答者中，只有少数人表现出持久和自维持的应答模式。希望在尽可能多的癌症患者中重复ICI治疗最持久的成功，就需要真正理解治疗背后的机制。在以前发表的文章中，我们已经指出，目前关于ICI治疗如何工作的封闭模型是错误的，因为它不能解释一些关键的观察结果，如扳机效应、超进展和与治疗相关的自身免疫攻击。另一方面，我们提出了一个基于PD1+ T细胞部分清除和随后剩余T细胞通过内稳态激活的替代模型。这个模型，我们称之为清除模型，可以解释上述所有令人困惑的临床观察结果。它还预测，在重复给予PD1/PDL1抗体(临床中的常见做法)的情况下，存活的免疫反应必须由PD1- T细胞介导。由于对ICI治疗的一些最显著和持久的反应不需要抗原释放治疗(如化疗)，因此它们也必须是自维持的。在此，使用真实病例，我们提供了证据，证明最有效和自维持的抗肿瘤反应可能由PD1- T细胞介导，这一观察结果支持了我们的ICI治疗清除模型。该观察结果对ICI治疗的当前临床应用提出了根本性的问题，并为寻找激活PD1- T细胞以产生抗肿瘤应答的方法指明了未来的方向。

介绍

多亏了过去十年的ICI治疗，今天毫无疑问的是，针对癌症的免疫反应是真实和强大的，如果以正确的方式激活，它可以根除临床环境中存在的几乎任何常见的肿瘤负担。然而，尽管过去几年人们寄予厚望并大肆炒作，ICI疗法迄今为止大多只是在各种临床试验中有效，而在现实世界中效果并不理想 [1，2]。为什么这两种环境之间会有如此大的差异还不清楚。我们自己的经验表明主流对治疗机制的理解上存在错误，因此，大约40%的情况下会出现错误应用，造成伤害而不是获益[3]。根据ICI治疗既定的机制，对肿瘤的免疫攻击导致肿瘤细胞表达PDL1，进而下调免疫反应，阻止免疫继续攻击肿瘤 [4]。ICI抗体封闭了表达PD1的T细胞与表达PDL1的肿瘤细胞之间的相互作用，从而使T细胞免受PDL1的抑制。基于这种机制，当我们观察到肿瘤对激活的免疫攻击产生抵抗时，我们就会应用ICI治疗，但观察到40%的患者随后经历了超进展[3]。此外，封闭模型无法解释三个令人困惑的临床观察结果。首先是在一些患者中观察到的“扳机效应”，这些患者由于各种原因只获得了一次使用该疗法的机会。他们的肿瘤对这种单一治疗的反应是持续的，甚至超过一年的时间。大多数持久应答者还显示，在停止治疗两年后，肿瘤继续消退[5-8]。第二种是与ICI治疗相关的超进展[9，10]。三是与治疗相关的自身免疫攻击[11]。此后，我们研究了应答者和非应答者之间的差异，并提出了新的ICI治疗机制模型。基于这个我们称之为清除模型[3]的新模型，肿瘤浸润T细胞的位置至关重要。因为位于间质的PD1+ T细胞会被抗体结合并通过包括ADCP在内的各种机制被清除[12]，而深度浸润肿瘤团块的T细胞由于缺乏抗体通路和/或缺乏PD1表达而得以幸免。这种清除会导致T细胞快速下降，随后是残留T细胞通过内稳态驱动形成扩增。这就是抗肿瘤T细胞非抗原特异性激活的原因。这种初始激活导致那些能够深度浸润肿瘤团块的T细胞扩增，从而产生最有效的反应。这个模型虽然可以解释封闭模型无法解释的三个最令人困惑的观察结果，但仍然留下一些令人困惑的问题有待回答。最具挑战性的是在临床环境中持续给药时所表现出来的持续应答。如果T细胞的位置可以为一些深浸润在肿瘤团块中的T细胞提供最初的隐藏位置，则随后的扩增将需要这些T细胞迁移出肿瘤团块并进入引流淋巴结以进行最有效的扩增。这种位置改变将使这些T细胞暴露并被抗体清除，除非这些T细胞不表达PD1。但临床观察表明，这些T细胞也可能表达PD1，容易受到抗体清除的影响。在相当多的病例中，我们观察到初始ICI抗体给药后的初始稳健反应在随后给药后转变为超进展(详见下文)。而另一方面，在持续抗体给药而没有持续抗原释放的情况下，有时又会维持一个长期而持久的应答。如何解释这两种情况下的差异也是一个挑战。在本报告的以下章节中，我们列举了四个真实世界的案例来说明几个要点，这些要点将共同构成一幅更大的图景。这些综合观察结果和合理的推断指出了一个未来的方向，在这个方向上，我们可能会找到激活最有效的抗肿瘤反应的方法。

病例描述

病例1：PD1抗体重复给药导致抗肿瘤T细胞清除和超进展

患者男，59岁，颈部有一个大肿块(图1-1)，活检时被诊断为黑色素瘤。PET-CT检查显示额外的骨转移(图1-2)。患者前额有一个凸起的黑痣，但活检未显示恶性细胞，因此该黑色素瘤的原发部位未知。患者向我们寻求治疗方面的帮助。我们首先检查了活检样本，以评估肿瘤复制模式和共存免疫状态。分析显示，肿瘤结构为典型的黑色素瘤，肿瘤细胞密集，细胞间缺乏间隙(图1-3，HE)。肿瘤复制活跃，Ki-67阳性率因区域不同大约40-70%(图1-3，Ki67)。肿瘤团块内有大量散在的T细胞(图1-3，CD3)。这些T细胞属于CD8亚型，有些呈激活状态。这些T细胞似乎具有抗肿瘤活性，因为在T细胞较少的区域肿瘤复制活跃，而在T细胞较多的区域，肿瘤复制则不太活跃。基于这些观察结果，我们认为这是一个高度活跃的肿瘤伴随有抗肿瘤免疫的病例。与确诊时的大多数患者相比，该病例的抗肿瘤免疫水平相对较强，尤其是肿瘤内的一些CD8 T细胞呈激活状态，T细胞与肿瘤复制之间存在明显的拮抗作用。

根据我们在过去7年中对数百份肿瘤样本进行评估累积的经验，对于确诊时的抗肿瘤免疫强度，本病例处于前30%的区间。此外，该病例中T细胞浸润的模式为“混合”型，根据ICI治疗清除模型可以预测PD1抗体治疗能够获益[3]。另一方面，我们观察到了T细胞对肿瘤复制的抑制，这表明肿瘤没有因为免疫攻击而表达PDL1，因为那样通常会加深Ki-67着色。第三方商业PDL1检测证实了这一点，该检测得出肿瘤无PDL1表达的结论(未显示)。肿瘤细胞在如此强烈的免疫攻击下不表达PDL1的原因尚不清楚。PDL1表达是由IFN-γ刺激的[13，14]，但这个病例不可能缺乏IFN-γ，因为我们看到肿瘤复制的明显抑制，这是T细胞释放IFN-γ的标志。一定有其他因素阻止肿瘤细胞表达PDL1。

无论肿瘤PDL1表达如何，我们基于ICI治疗清除模型来选择患者时，预示这将是一个可以获益的病例。因此，我们建议采用PD1抗体治疗。与PD1抗体的主流使用方法不同，我们基于清除模型的使用取决于抗体的扳机效应，除非必要，不需要重复给药。由于PD1+ 的T细胞会被清除，而这种清除在不同患者中可能存在差异。这些患者可能表达了 FC 受体基因的不同等位基因，从而影响IgG1被巨噬细胞结合和T细胞被清除。所以我们在给予PD1抗体(Keytruda，200mg)之前和之后监测了患者的血细胞计数。血细胞计数表明，抗体给药后一天T淋巴细胞下降23%(同时未见其他白细胞下降)。在接受ICI治疗监测的患者中，这种下降幅度并不大，通常在抗体给药后立即下降超过30%(我们未发表的结果)，表明T细胞清除可能并不严重。由于T细胞激活取决于残余T细胞内稳态驱动的恢复，因此少量清除会驱动少量恢复，并可能导致T细胞激活减少。

治疗两周后，我们观察到颈部肿瘤结节有应答。截至第5周，该结节已显著缩小至先前体积的20%以下(图1-4）。到第6周，这种应答开始停止，颈部肿瘤缓慢反弹。患者及其家属咨询的其他医生均将应答停止归咎于没有持续给药(每三周一次PD1抗体)和没有联合化疗。由于第一次PD1抗体治疗未显示任何短期进展的迹象(根据我们的清除模型，这一现象与PD1+ 抗肿瘤T细胞的暂时性清除相关)，我们认为两个月后再次重复治疗应该是安全的，但我们反对每三周重复给药一次，因为抗肿瘤T细胞可能被过度清除，导致肿瘤超进展而完全失去控制。尽管有我们的警告和解释，病人还是和他的家人一起接受了其他医生的建议。恢复PD1抗体连续给药后6周，肿瘤进展加速变得明显，颈部肿瘤迅速变大和变硬，先前的单个结节已分裂为四个突出结节，占据颈部相当大的面积(图1-5)。患者还出现了背部和腿部疼痛。根据我们之前的警告，我们意识到患者的抗肿瘤免疫功能衰竭，并因此出现了超进展。然而，治疗医师坚持认为，这是由肿瘤变异出的耐药克隆引起的，而不是抗肿瘤免疫的丧失。他们坚持继续进行抗体给药。为了解决关于肿瘤进展原因的争议，我们要求对颈部肿瘤再次进行活检，并再次进行PET-CT检查，以了解肿瘤进展是否仅限于颈部肿瘤，还是出现了新的转移。如图1-6所示，该PET-CT显示身体许多部位大量存在新的转移灶。进行肿瘤活检显示肿瘤团块内有活性增殖肿瘤细胞，无T细胞(图1-7)。总之，这些观察结果支持了全身抗肿瘤免疫完全丧失的结论，这一结果只能用抗体介导的T细胞清除来解释。

根据这些检测结果，所有之前参与的医生都放弃了对该患者的进一步治疗。我们向患者及其家属解释说，只要不再给予抗体，抗肿瘤T细胞的清除是暂时的。免疫功能最终可随时间(2-3个月)恢复。为了防止更多的转移灶形成，我们建议间歇性化疗以抑制新形成的转移灶。然而，由于缺乏当地医院的配合，我们的化疗建议未得到实施。在等待期间，即末次抗体给药后约9周，患者开始出现规律的39°C发热，每天持续数小时，持续两周以上。尽管发高烧，但患者感觉基本正常。这明显不同于常见的晚期癌症患者所表现的“癌烧”。发热时，我们注意到颈部肿瘤部分软化，表明抗肿瘤免疫功能恢复。为了证实这一点，我们建议再次对颈部肿瘤进行活检。活检确实证实了T细胞在肿瘤内的恢复(图1-8)。基于这一观察，我们提出了两个方案:1)再次回到PD1抗体治疗，但只进行一次；2)采用化疗激活抗肿瘤免疫。由于之前的不良经历，患者及其医生不接受再次使用ICI治疗的想法，因此他们选择尝试一个疗程的化疗。化疗的反应如此强烈，不仅颈部肿瘤迅速萎缩，而且在消退后，颈部肿瘤周围也出现了大面积的色素脱失。同时，CT和MRI检查显示许多先前确定的转移灶消退(未显示)。随着这种大规模肿瘤消退，患者进入快速体重减轻状态，伴有类似癌症恶液质的严重不适。我们认为，这是由于对巨大肿瘤负荷的免疫反应过强所致，应部分抑制以挽救患者生命。尽管我们建议使用免疫抑制剂(例如皮质类固醇)，但患者及其医生未进行相应干预。不久之后他就去世了。

ICI治疗后，应答从一个极端到另一个极端大幅波动的原因是什么？我们基于清除模型的分析指出，在单次给予PD1抗体后，抗肿瘤T细胞开始激活。继续给予抗体导致激活的T细胞几乎完全被清除并造成超进展。在停止给予更多抗体后，抗肿瘤T细胞随后恢复，形成自发的肿瘤控制。但我们并未预期紫杉醇单疗程化疗后会出现显著的持续抗肿瘤反应，最终导致患者死亡。黑色素瘤免疫治疗后的黑色素细胞色素脱失已有描述。通常与自维持的抗肿瘤免疫反应有关，常常导致癌症被根除[15]。

显然，这种类型的持续反应通常与化疗无关，更不用说单一疗程的化疗。在本病例中观察到的这种持续应答的真正原因不是来自化疗药物的作用，而是来自恢复的抗肿瘤T细胞的激活。由于我们观察到ICI治疗的最佳反应是由PD1- T细胞介导的(见后文病例3部分)，因此我们回去检查了第一份和第三份活检样本中T细胞的PD1表达状态(因为第二份活检不含T细胞)。如图所示(图1-9)，在确诊时进行的首次活检样本中，肿瘤团块内几乎所有T细胞均表达PD1。形成鲜明对比的是，在连续PD1抗体停止后9周的自发性肿瘤控制时进行的第三次活检中，肿瘤中有大量T细胞，但这些T细胞中只有不到一半表达PD1。我们不能断定这些PD1- T细胞在化疗后持续抗肿瘤应答期间会保持PD1- ，但基于我们对其他病例(病例3)的观察，我们认为会。甚至尚不清楚化疗后的持续抗肿瘤反应是否是由单疗程化疗激活的，也可能是化疗前已经观察到的自发T细胞恢复过程的延续和扩大。在这种情况下，我们将看到PD1抗体对PD1- T细胞的选择过程，即仅使PD1- T细胞扩增。如果在观察到超进展后未停止PD1抗体治疗，则在最终仅剩PD1- T细胞时，我们可能会看到随后的肿瘤消退。由于ICI治疗后一些最持久的反应是在持续抗体给药下进行的，这可能是一个合理的解释。

病例2：肿瘤表达PDL1不是避免ICI治疗后超进展的安全指征

在上述病例中，我们的评估和第三方免疫组化分析均显示PDL1表达状态为阴性。这并不是不应在该病例中使用抗PD1的原因，因为在首次PD1给药后非常有效。另一方面，主流指南通常使用肿瘤的PDL1表达状态来选择ICI治疗候选人。临床数据已经确立了肿瘤细胞的PDL1表达水平与ICI治疗应答之间的相关性[16]。尽管此后许多研究表明，PDL1阴性状态的患者也可受益于ICI治疗，但PDL1在肿瘤中的高表达通常是更好应答的指标[17]。鉴于肿瘤表达PDL1是受T细胞释放的IFN-γ刺激[13，14]，因此肿瘤细胞PDL1的这种高表达至少表明抗肿瘤T细胞位于附近并且具有释放IFN-γ的能力，这是Th1型抗肿瘤免疫应答的标志。即使采用我们的清除模型，T细胞在肿瘤中的这种邻近位置也经常表明肿瘤团块中存在混合浸润的T细胞，这是ICI治疗可能获益的一个指标。但PDL1的肿瘤表达状态并不能保证不会发生ICI抗体对抗肿瘤T细胞的清除。清除的保护因素是:1) T细胞位于肿瘤团块内；2)T细胞上的PD1表达缺失，但T细胞是否刺激肿瘤细胞表达PDL1并不重要。以下案例是这一点的例证。

患者男，52岁，因持续咳嗽和胸痛被诊断为肺癌。PET-CT检查显示左肺有一个4CM的原发灶，全身有多个转移灶(图2-1)，从而确定为IV期。基因检测显示没有任何可用的靶向药。这位患者是一名经过培训的内科医生，他熟悉目前关于IV期肺癌的治疗指南，他来到我们这里进行预后评估并寻求治疗建议。我们要求通过检查活检样本来评估肿瘤复制模式和共存免疫状态。对其活检样本的分析显示(图2-2)为低分化腺癌(图2-2，HE)，具有少量自主复制肿瘤细胞(图2-2，Ki67)，细胞核增大，Ki-67深染，这是局部炎症趋化活跃的迹象(症状加重的原因)。活检样本中存在大量T细胞(图2-2，CD3)。

T细胞主要分布在肿瘤小团块周围的间质中，但有部分明显浸润在团块内部，与肿瘤细胞形成混合浸润模式。这些T细胞大多为CD8亚型，未显示激活状态。总之，这些观察结果将该病例归为伴有多发转移同时具有相对较强共存免疫的一类。根据TNM分期，这是一个IVb期，预后最差的非常晚期的癌症，而根据我们加入抗肿瘤免疫状态定义的分期系统，该病例并不像看起来那样绝望，如果抗肿瘤免疫能够被激活以灭活大多数转移，则该病例可以挽救，具有良好的长期预后。基于这一评估，我们建议使用ICI疗法激活抗肿瘤免疫，即使用PD1抗体的单一疗法。需要指出的是，第三方对肿瘤PDL1表达的分析也支持选择ICI治疗，该分析显示> 90%的肿瘤细胞表达PDL1(图2-3)。

然而，根据对患者活检样本的观察，我们向患者明确表示，PD1抗体治疗只能给药一次。图2-4为首次给予PD1抗体前及给药后不同时间点敏感肿瘤标志物的变化。所有三种敏感标志物在抗体给药2周后均出现暂时反弹，这是ICI治疗中常见的现象。这被清除模型解释为当那些间质浸润T细胞被抗体清除时的短期效应。由于这些T细胞原本负责控制肿瘤的进展，因此去除它们将导致肿瘤反弹。随后，在接下来的12周内，所有肿瘤标志物快速且持续下降，此时仅观察到标志物CEA反弹。基于我们之前描述的清除模型，预期单次PD1抗体治疗后会出现持续反应[3]，但CEA在另外两种标志物没有反弹的情况下出现反弹是意外的，表明是逃逸事件，而不是ICI治疗激活的抗肿瘤免疫普遍衰退。为了证实这一点，我们要求进行第二次PET-CT检查。图2-5显示了两种PET-CT结果的比较。这两次检查之间的肿瘤负荷存在显著差异，说明单剂量PD1抗体激活了显著的抗肿瘤反应。这种强烈而持久的反应支持了清除模型所解释的扳机效应[3]。此外，我们还发现了CEA反弹的原因，因为在所有先前确定的结节消退中，有一个新发的骨转移(图2-6)。这清楚地表明，正在进行的抗肿瘤免疫无论强度如何，都无法识别该骨转移。由于其他两种肿瘤标志物(Cyfra21-1和NSE)未出现反弹，因此这两种标志物并不代表此处骨转的复制，因而此处很可能是一种新的突变，也是一种免疫逃逸。

鉴于总体肿瘤消退伴有一处逃逸转移，我们建议对该骨转移进行放射治疗，同时让其余肿瘤继续消退。但患者及其家属咨询的其他医生坚持给予更多的PD1抗体。虽然我们解释了ICI治疗具有扳机效应的原因，以及初次PD1抗体显示了三个月的持续应答支持这一观点，并且该肿瘤中的T细胞浸润模式可能无法承受ICI抗体的重复给药，但患者选择对新发现的骨转移灶进行放射治疗，同时重复PD1抗体给药。放疗和连续两次PD1抗体治疗后两个月，肿瘤标记物显示快速反弹，表明肿瘤失去控制。患者回到我们身边寻求解释和建议。我们要求进行第三次PET-CT检查，以观察肿瘤负荷的变化。如图2-7所示，截至第三次PET-CT检查时，包括原发灶在内的一些先前消退的肿瘤明显复发。此外，还有一些新发现的转移灶。通过第二次PET-CT(图2-6)鉴定的单个骨转移灶(经放射治疗)显示代谢减少。结合迅速反弹的肿瘤标志物，这些观察结果表明，负责抑制肿瘤的T细胞被重复的PD1抗体清除，因此我们看到原发灶迅速复发，并出现新的转移灶。相反，由于第二次PET-CT检查发现的单个骨转移是免疫逃逸，因此T细胞清除不会影响其生长。事实上，这个转移灶受到放射治疗的抑制，并表现出代谢活性降低。

由于肿瘤的PDL1表达极高，该病例被认为是ICI治疗的潜在高应答者(图2-3)。另一方面，由于低分化的肿瘤结构和肿瘤团块存在混合T细胞浸润，清除模型也认为其是ICI治疗的潜在受益者(图2-2)。ICI治疗的实际反应是显著的抗肿瘤效应，在初始ICI治疗前后进行的两次PET-CT检查证实了这一点(图2-5)。随后的PD1抗体给药是在三个月后进行的，当时除一种突变逃逸外，肿瘤控制仍然明显。之前的显著应答到后来的超进展这一逆转很难归咎于第二次PD1抗体给药，即使是基于清除模型也是如此。 

导致急剧逆转的原因应该是第三次抗体给药与第二次间隔过短（三周）。根据清除模型，除非T细胞不表达PD1，否则会对未隐藏在实体瘤内且存在于间质的T细胞进行抗体结合和清除。第2次抗体给药后，深藏于肿瘤中的T细胞迁移出肿瘤团块进行扩增，此时PD1抗体最容易接近它们进行清除。因此，此时重复给予抗体会导致负责控制肿瘤的T细胞大量被清除，导致肿瘤控制完全丧失。实际的超进展支持了这一推测。因此，该事件预测，初始PD1抗体后的所有抗肿瘤T细胞仍保留PD1表达，因此易于被PD1抗体去除清除。为了测试这一预测，我们回去查看图2-2所示活检样本中的PD1表达。图2-8显示，确诊时，浸润肿瘤的所有T细胞均表达PD1。根据这一观察结果，我们可以假定在去除间质T细胞后，从肿瘤团块中出来进行稳态扩增的T细胞可能会保留其PD1表达状态。因此，这些T细胞易受抗体介导的清除的影响。如果该病例未接受后续的PD1抗体治疗，那么由初始ICI治疗激活的T细胞是否能维持抗肿瘤反应，直至肿瘤完全消退呢？这是一个有趣的问题。

病例3：PD1阴性T细胞可能是ICI治疗产生持续应答而不发生超进展的原因

清除模型的一个关键预测是，重复ICI治疗后的持续抗肿瘤反应必须由PD1- T细胞来进行。由于已知PD1由激活的T细胞表达[3]，目前主流ICI治疗的前提是基于封闭模型的抗肿瘤T细胞表达PD1[17]。人们并不清楚是否存在不表达PD1的激活T细胞，更不用说由这些T细胞负责最佳的抗肿瘤反应。作用在T细胞上的PD1抗体通过PD1- T细胞来激活一个免疫应答，这听起来相当矛盾，但如果清除模型是正确的，那么这一定是真的。为了检验这一预测，我们观察了持久ICI治疗应答者的手术肿瘤样本中，激活T细胞的PD1表达。下面就是这样一个例子。

患者男，60岁，2016年因持续性胸痛住院。胸部CT发现左肺门附近有一个大(8cm)结节，纵隔内有多个肿大淋巴结。活检证实存在低分化腺癌。医院选择对原发灶进行化疗后再进行放射治疗。这种联合治疗导致短期肿瘤缩小，但随后在放射后两个月肿瘤复发和远处转移至肩部、肾上腺、大脑和肝脏。经肩部肿块活检证实为肺转移，该病例被认为无希望，一名家属向我们寻求帮助。我们查看了肩部转移灶的活检样本，以评估是否存在抗肿瘤免疫。图3-1显示了活检样本的HE、Ki-67和CD3染色。如图所示，这是一个腺鳞癌混合癌的低分化肿瘤(HE)，肿瘤复制活跃，肿瘤细胞有强烈的Ki-67表达，部分区域达到70%以上(Ki-67)。整个肿瘤区域内存在大量T细胞，有的与肿瘤细胞混合，有的位于间质(CD3)。这些观察结果解释了之前对化疗和放疗的应答，以及随后的复发转移。首先，该病例为低分化肿瘤(腺癌和鳞状细胞癌的混合类型)。肿瘤恶性程度高，复制活跃，但同时也伴随大量抗肿瘤免疫。对初始化疗的反应是由于化疗激活了抗肿瘤免疫。但随后的放疗破坏了原发灶以及肿瘤内存在的大多数抗肿瘤免疫。这种放疗介导的抗肿瘤免疫抑制在临床中很常见，通常超过放疗激活抗肿瘤免疫的可能 (我们未发表的观察结果)。正是这种免疫抑制导致了原发灶的复发和远端转移的建立。然而，随着肿瘤负荷的恢复，共存免疫恢复，这就是我们在活检样本中看到的情况(图3-1)。共存免疫的这种重建将防止出现新的转移，并可以通过激活这个抗肿瘤免疫来支持后续治疗。理论上，如果我们能够灭活所有转移灶，则在最终切除原发灶后，该病例可能被治愈。基于这一观点，我们建议进行新一轮的肿瘤减负治疗。

脑转移灶采用短暂的伽玛刀治疗。通过监测敏感的肿瘤标志物，我们可以评估对治疗的应答。如图3-2所示，该治疗使CEA明显下降。然后对肩部转移灶进行局部介入化疗。CEA在治疗后继续下降。随后的全身化疗未产生进一步的应答，这可以解释为PDL1表达导致的肿瘤耐药的结果。因为在当时，肿瘤表达PDL1被作为PD1抗体ICI治疗的指标，因此我们建议进行PD1治疗。我们还建议局部使用IL-12，这是一种在临床前模型中具有显著抗肿瘤活性的实验药物[18，19]。在短暂的僵持后，这种组合确实使CEA持续且深度下降。当时，我们尚未开发用于ICI治疗的清除模型，因此每三周给予一次抗体，共给予三次。从肿瘤标志物的变化可以看出，这种PD1抗体的重复给药并未导致肿瘤复发。在持续缓解期间，采用射频消融(RFA)治疗肾上腺转移灶。

最后，随着肿瘤标志物显示肿瘤持续消退，我们建议通过手术切除剩余的原发灶和周围纵隔淋巴结，这是可能实现该病例临床治愈的关键步骤。为进行手术评估，进行了PET-CT检查。如图3-3所示，有三个主要的SUV高区域：原发灶发出微弱信号，SUV低(约5)，纵隔转移灶发出SUV高(约9)，肩部转移灶发出SUV高(约13)。

该信号分布模式提示纵隔和肩部存在有活性的转移灶，这与肿瘤标志物持续下降达到“正常”范围(图3-2)明显矛盾，肿瘤标志物表明几乎不存在有活性的肿瘤复制。由于我们自身的经验表明高PET-CT信号可能是由免疫反应/炎症引起的(我们未发表的结果)，我们将PET-CT的高SUV信号作为免疫反应的指征，并继续建议进行手术。

术后分析证实了这一推测。(图3-4和3-5)分别显示原发灶和纵隔转移灶的手术肿瘤样本的HE、Ki-67和CD3染色。可见，HE染色显示肿瘤结构低分化。两种组织之间有明显的差异，原发灶中肿瘤细胞呈团块状（实性），而纵隔中肿瘤细胞较分散。两个样本中的肿瘤复制也不同，因为在纵隔肿瘤中仅观察到散在的复制肿瘤细胞(图3-5，Ki-67)，而在原发灶中观察到更多表达Ki-67的肿瘤细胞(图3-4，Ki-67)。原发灶含有更多的肿瘤细胞且具有更活跃的肿瘤复制，但是在术前PET-CT上的代谢信号(图3-3，原发灶)远少于纵隔转移灶(图3-3，纵隔转移灶)。因此正如我们推测的，PET代谢活性的这种差异可能是由免疫反应的差异引起的。尽管两个样本均含有大量T细胞，但从密度上看，在纵隔肿瘤中发现了更多T细胞。此外，与原发灶相比，该肿瘤中的T细胞显示出激活状态(圆形染色模式)。这些观察结果表明，在这种情况下，免疫反应对观察到的PET信号贡献较大。根据这一事实推断，我们认为肩部转移灶虽然未被切除，但其免疫活性较高，最终可能根除残留肿瘤，这一推测经时间证明是正确的。患者在手术后6年多仍未复发。

由于肩部转移未被切除而仅通过免疫被根除，说明本病例在接受ICI治疗后表现出了持久的抗肿瘤应答。PD1抗体虽未长期连续给药，但也连续给药3次，基于上述两例病例，这种做法可能会导致抗肿瘤免疫清除和肿瘤复发。然而。在这个病例中没有发生这样的事件。根据预测，这种情况下的T细胞必须耐受清除，因此必须是PD1阴性。因此，我们希望观察最终手术样本中激活T细胞的PD1表达状态。如图3-6所示，纵隔肿瘤手术标本中存在大量T细胞(CD3，100倍)，且这些T细胞大多呈激活状态(CD3。400X)。但说到PD1的表达。几乎全部为PD1阴性 (PD1，100倍)。在手术样本中的少数PD1+ T细胞中，大多数未表现出激活状态(PD1，400X)。这些观察结果表明，重复PD1抗体治疗后的强抗肿瘤反应是由PD1- T细胞介导的，因此支持ICI治疗的清除模型。有趣的是，残留肿瘤细胞也表达高水平的PDL1(未显示)，表明PD1- T细胞介导的强抗肿瘤免疫应答也是Th1型，释放IFN-γ并刺激PDL1的肿瘤表达。然而，这些T细胞未受到PDL1肿瘤表达的干扰，以自我维持的方式攻击肿瘤，直至抗原完全清除(肿瘤根除)，并转化为强有力的保护性免疫记忆，确保临床治愈。

病例4：PD1阴性T细胞参与的另一种持久和自维持的抗肿瘤应答

在存在PD1抗体的情况下，PD1- T细胞的优先扩增是清除模型的自然结果。然而，我们发现，即使在其他不是ICI治疗激活的持久抗肿瘤反应中，PD1- T细胞也可能起主要作用。下面就是这样一个例子。

患者女，64岁，因阴道出血，下腹痛，遂去医院就诊。检测结果显示为宫颈癌。活检病理证实为宫颈鳞癌。肿瘤标志物SCC升高。除>3cm的原发灶外，还存在多发性盆腔转移。医院选择了宫颈癌的标准化疗和放疗计划。治疗后，原发灶几乎消失，SCC降至正常范围以下，对患者进行观察。八个月后，SCC开始上升，随后的PET-CT显示两处明显的肺转移(图4-1)。一位家属向我们寻求帮助。我们注意到原发灶和盆腔转移灶没有复发，表明先前的化疗和放疗已经完全消除了这些肿瘤负担。但鉴于放疗通常会导致免疫抑制，我们怀疑肺转移是这种抑制的结果。如果是这样，一旦建立新的转移灶，先前抑制的免疫功能可能会恢复，并与肿瘤形成新的平衡。抗肿瘤免疫的这种恢复通常伴随着敏感肿瘤标志物的自发稳定甚至下降，因为肿瘤复制受到恢复的免疫的抑制。事实上，几周后，我们发现SCC自发出现短暂下降(图4-2)，这表明抗肿瘤免疫功能恢复。由于有共存免疫的存在，我们建议化疗来激活这个免疫。一个疗程的化疗导致SCC持续下降(图4-2)5周，随后出现反弹。第二疗程化疗未引起SCC下降，而是迅速升高(图4-2)。在已知存在抗肿瘤免疫的情况下，这种肿瘤标志物反弹反映了肿瘤复制的反弹，这通常是PDL1肿瘤表达的结果(我们未发表的观察结果)。这是因为化疗激活了抗肿瘤免疫，释放IFN-γ，进而刺激肿瘤表达PDL1。我们已经准备在第二疗程化疗前联合使用IL-12进一步激活抗肿瘤免疫[18，20]。由于知道IL-12修饰的T细胞可能不受PDL1的抑制 [21]，因此针对这种SCC反弹，建议给予IL-12。三次IL-12注射后，SCC持续快速升高，达到甚至超过确诊时原发灶和盆腔多发转移都存在时的水平。CT成像显示两个肺转移灶大小增加(约3 cm)，无其他新转移灶，支持SCC快速增加是现有肿瘤负荷导致肿瘤表达PDL1的结果。由于IL-12给药后未观察到肿瘤应答，因此建议使用PD1抗体进行替代治疗。

PD1抗体治疗前一天，SCC急剧下降(图4-2)。这种下降发生在第2次化疗后4周，而先前则快速升高，这相当令人惊讶，但仍与我们预测的IL-12给药目的一致。看到这种突然的反应，我们取消了ICI治疗，继续跟踪肿瘤标志物的变化。在接下来的一个月中，SCC持续稳定下降，两个肺转移灶缩小至约1-2 cm大小。由于不确定这种抗肿瘤反应是否能消除整个肿瘤负担，且这两个转移灶的位置便于手术，我们建议通过手术切除它们，以确保临床治愈的机会。患者术后5年多仍无复发。 

术后分析显示，手术样本中出现了显著的抗肿瘤反应。如图4-3所示，肿瘤具有典型的鳞状细胞结构(HE)，支持其为宫颈癌的来源。肿瘤复制受到抑制，因为大多数Ki-67阳性肿瘤细胞仅显示微弱染色(Ki-67)。正如预期，肿瘤中大量存在T细胞(CD3) ，主要是CD8亚型。这些T细胞多数呈激活状态。

这些观察结果表明，术前化疗和IL-12治疗确实激活了强烈的抗肿瘤反应。我们还对肿瘤切片进行了PDL1表达染色，结果显示大多数剩余肿瘤细胞，尤其是位于T细胞附近的肿瘤细胞表达PDL1(未显示)。该观察结果证实了我们之前的推测，即第2次化疗和IL-12后SCC的快速增加确实是由PDL1的肿瘤表达引起的。由于IL-12后SCC的突然下降不是由于PDL1肿瘤表达的丧失，因此它一定是由不受PDL1抑制的抗肿瘤免疫反应引起的。在最近认识到持久的抗肿瘤反应可能由PD1- T细胞介导后，我们又回去用PD1抗体对本病例的肿瘤切片进行染色。如图4-4所示，在肿瘤切片中显示大量CD3的同一区域，PD1+ T细胞少得多。少数表达PD1的T细胞没有被激活。因此，该回顾性分析证实，在未应用ICI治疗的情况下，强烈而持久的抗肿瘤应答也是由PD1- T细胞介导的。

讨论

PD1是一种在激活的T细胞表面表达的分子[22]。但许多研究也表明，PD1的表达是肿瘤环境中T细胞耗竭的标志[23] [24]。对PD1表达的总体分析表明，它是T细胞功能的负调节因子。另一方面，肿瘤细胞收到IFN-γ的刺激而表达PDL1[13，14]。因此，存在肿瘤团块内的肿瘤浸润T细胞与表达PDL1的肿瘤细胞相遇的情况。净效应是抗肿瘤T细胞和肿瘤同时存在，这种情况我们称之为共存免疫。许多人倾向于认为，生长中的肿瘤内部的抗肿瘤免疫可能已“耗竭”，但很少人意识到其“功能性”。

这些肿瘤浸润性T细胞的功能包括:1)限制肿瘤的生长(增殖/复制)速率；和2)限制新转移灶的建立。当T细胞被去除时，这些功能在动物模型中很容易观察到，但在人类癌症患者中很难识别，直到最近ICI治疗带来了许多超进展病例。ICI治疗诱导的超进展的本质是抗肿瘤T细胞的清除，许多人认为这些T细胞是与生长中的肿瘤共存的耗竭细胞。通过上面这些观察，我们不应认为这些共存的T细胞“衰竭”和“无功能”，而应认识到它们作为功能性抗肿瘤T细胞的重要作用。显然，这些T细胞不能根除现存的肿瘤，这也是许多人认为它们无功能的原因。除了上述4个病例，我们在过去的几年中对个体癌症患者的抗肿瘤免疫状态进行评估时也经历了许多其他病例，从这些病例来看，这些T细胞似乎无法克服其伴随的肿瘤负担，因为它们通常未被“完全”激活。首先，它们的数量通常较低，虽然随着肿瘤负荷的增加数量会不断增加，但不会超过它们所对抗的肿瘤细胞。其次，这些T细胞并未处于激活状态。这通常可以通过观察这些T细胞的着色模式检测到，因为激活的T细胞显示出环形着色（空心），而不是充满整个细胞 (一个很好的例子是图3-6中CD3阳性T细胞的形状，400X)。在上述病例3和病例4中，我们可以看到哪种T细胞模式与免疫攻击导致的肿瘤消退相关，即至少存在大量的T细胞和激活状态。但仅满足这两个条件仍不足以见证这两个病例中的持续肿瘤消退，因为在我们的许多病例中，化疗激活T细胞后，这两个条件已得到满足(我们未发表的观察结果)。常规化疗中激活的T细胞反应与病例3和4中的反应之间的最大差异似乎是后者的自维持特征。自我持续的免疫应答不需要通过重复释放抗原(例如，通过化疗药物杀死肿瘤)。一旦被激活，它会搜索抗原并清除，同时保持激活状态直至抗原被完全清除。这在免疫介导的抗病毒应答中很常见，因为不需要人的干预，结果总是完全根除病毒。但在抗肿瘤免疫反应方面，自维持反应却很少见到。原因有过讨论，但没有一致的线索。

许多研究表明，浸润的T细胞处于耗竭状态[23，24]。随后，这被归因于PDL1表达对T细胞功能的下调。从自维持抗病毒应答的角度来看，这一论点似乎没有意义，因为抗病毒应答本质上是Th1型，并且也应刺激受感染细胞或周围未感染内皮细胞表达PDL1。此外，上述病例3和4中的免疫应答也刺激肿瘤细胞表达PDL1。当然，一种解释是，这两种情况下的T细胞不表达PD1，因此无法与肿瘤细胞上的PDL1相互作用。在病例3中，可通过持续存在PD1抗体来选择PD1- T细胞。但病例4无此选择，因此PD1- T细胞可能是一组自然介导自维持免疫反应的T细胞。相比之下，我们在肿瘤内看到的抗肿瘤T细胞更可能处于失活状态，尽管它们确实具有抗肿瘤活性。问题是如何激活一个强大的和自维持的抗肿瘤反应？

在ICI治疗的情况下，这有时是根据清除模型通过清除PD1+ T细胞来选择PD1- T细胞实现的。清除会导致T细胞暂时内稳态失衡，随后任何存活的T细胞都会扩增。当所有抗肿瘤T细胞均为PD1+ 并被清除时，将会出现短期的肿瘤控制丧失和可能的肿瘤生长。但是，当一些T细胞(尽管PD1呈阳性)隐藏在抗体结合不到的肿瘤团块内时，它们可能会通过内稳态恢复而被激活。这种激活导致T细胞数量增多，并改变T细胞的激活状态。这些T细胞依次浸润和破坏肿瘤，产生抗肿瘤反应。在病例1和2中，这似乎是最初的PD1抗体后的情况。但是从这两种情况下随后的超进展来看，内稳态激活本身似乎并不会导致产生PD1- T细胞。PD1- T细胞如何产生的问题仍然是个谜。但总有这种可能性，即共存免疫中存在一些天然存在的PD1- T细胞，在PDL1介导的抑制作用下，这些T细胞会比PD1+ T细胞容易扩增。也有可能T细胞的激活本身也会导致从PD1+ T细胞向PD1- T细胞的转变。在这方面，如果我们知道如何将更多的T细胞转化为PD1- T细胞，那么更好地控制肿瘤的机会肯定会增加。在这方面，病例4中使用的IL-12可能是实现这一目标的一种方法。这与已报道的IL-12修饰导致PD1表达丧失的发现相一致[21]。病例3和4均使用了IL-12。很明显，在病例4中，该治疗有效激活了不受PDL1干扰的应答，最有可能是激活了PD1- T细胞的应答。但其在病例3中的作用尚不清楚。我们认为，ICI疗法激活了抗肿瘤反应以克服化疗耐药，因为IL-12是在看到肿瘤开始消退后使用的。如果IL-12进一步有助于推动PD1- T细胞反应，则不会改变我们的结论，即持续ICI治疗未中断此类反应。IL-12曾用于其他有益处的病例(我们未发表的结果)，但我们很少看到如病例3和病例4中所见的显著抗肿瘤反应。另一方面，我们有证据表明，在肿瘤疫苗等局部环境中由IL-12激活的T细胞通常容易被PD1抗体清除，这表明IL-12修饰本身并不能保证产生PD1- T细胞。

以上四个病例的综合解读解决了主流封闭模型和我们的清除模型之间关于ICI治疗真实工作机制的争议。争议解决之后的一个讽刺性问题是：如果PD1抗体是为了释放PD1+ 抗肿瘤T细胞的抗肿瘤效应，那么这种抗体在由PD1- T细胞介导的持久应答中有什么用途。目前ICI治疗的临床实践是每三周重复进行抗体给药。一些持久应答者在1-2年内接受了数十剂抗体。有这个必要吗？ICI治疗开发商当然没有证据证明有必要持续给予PD1抗体。其持续给药是基于封闭模型的自然思维。另一方面，基于清除模型，ICI治疗具有扳机效应，仅需单剂抗体即可产生T细胞激活和抗肿瘤反应。病例1和2在初始治疗后证明了这一点。这两个病例还表明，重复给予抗体可能会将先前的抗肿瘤反应逆转为超进展。

我们没有真实世界临床中发生过多少此类病例的准确描述，但根据我们自身的经验，约40%经ICI治疗的病例最终失去了对肿瘤的控制。ICI治疗的这种高损益比可能解释了ICI治疗在现实世界中使用时应答率低且缺乏明确获益的原因[1，2]。另一方面，自我们在过去15个月认识到清除模型以来，我们在选择潜在应答者和避免受到ICI治疗伤害方面的准确率超过了90%。在我们不知情的情况下使用ICI治疗并产生危害的少数病例中，没有例外的情况是，如果由我们来评估是否该对这些病例使用ICI治疗，我们不会建议使用。这些临床记录表明清除模型一定是正确的。如果被主流医学采用，许多生命可以被拯救。毕竟，ICI治疗是癌症管理的一个重大发展，它就像一把双刃剑，可能对患者有利，也可能对患者有害。通过了解其真正的工作机制，我们应该能够在保证获益的同时预防伤害。

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